庆大霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究(一)

【摘要】 目的 对庆大霉素单克隆抗体的制备以及检测进行研究； 方法 本研究采用碳二亚胺法将庆大霉素与载体蛋白偶联形成完全抗原，用基质辅助激光解吸／电离质谱进行了表征，以人工抗原免疫BALB／C小鼠； 结果 通过杂交瘤技术获得了分泌抗庆大霉素单克隆抗体并能稳定传代的杂交瘤细胞株，建立了庆大霉素间接竞争ELISA检测方法，其线性检测范围为0．1～5 ng／mL，半数抑制浓度(1C50)为0．8 ng／mL，与其他化合物的交叉反应率小于0．01％。?
【关键词】 庆大霉素 制备 检测?

庆大霉素是由小单胞菌产生的一种氨基糖苷类抗生素，对多种革兰阳性和阴性菌都具有显著的抗菌效果，作为饲料添加剂和治疗疾病的抗生素广泛应用于畜牧业。然而，庆大霉素对人类具有明显的毒害作用，对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重。庆大霉素残留的ELISA检测国外已有报道，但是利用ELISA法研究其在牛奶中的残留规律，国内外尚未见报道。?
本文合成了庆大霉素的免疫原和包被原，制备了单克隆抗体，采用MALDI―TOF MS对蛋白偶联抗原进行了表征，建立了检测庆大霉素的酶联免疫检测法，并成功地用于牛奶中庆大霉素的实际检测。?
1 材料与方法?
1．1 试剂：庆大霉素硫酸盐、血蓝蛋白丁二酸酯(sKLH)、牛血清白蛋白(BSA)、碳化二亚胺盐酸盐(EDC?HCI)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、HRP标记羊抗鼠IgG：SIGMA；PEG 1500：Gibco。?
1．2 实验动物BALB／C小鼠，购于济南生物制品所。?
1．3 庆大霉素全抗原的合成鉴定?
1.3．1 免疫原的合成：取40mg庆大霉素硫酸盐和12mgsKLH溶于1．5 mL PBS，在磁力搅拌器中进行均匀地搅拌。取280mgEDC?HCl溶于lmL PBS中，调pH至7．5，再慢慢地滴加到上述混合溶液中，并且在室温下搅拌1 h左右，然后于5℃放置2d。用PBS透析3d后，分装，―20℃贮存。?
1．3．2 完全抗原的鉴定：利用MALDI―TOF MS测定BSA及genta―BSA分子量，并根据分子量计算偶联比率。?
1．4 单克隆抗体制备?
1．4．1 免疫方法：首免采用CAP―BSA与等量福氏完全佐剂注射器互推法乳化完全后腹腔注射，剂量为100μg／只。2周后，换用福氏不完全佐剂二免，以后每隔14天强免1次。三免后8d，小鼠断尾采血，用间接ELISA方法检测血清效价，直至血清效价达到1：8000以上。融合前2d，不加佐剂尾静脉注射强免1次，按常规方法融合免疫脾细胞和SP2／0骨髓瘤细胞。?
1．4．2 细胞融合取小鼠脾细胞与Sp2／0骨髓瘤细胞在PEGl500作用下融合。将融合后的细胞悬液加入含饲养细胞的96孔细胞培养板中，以HAT培养基选择培养。?